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浓缩胶和分离胶

发表时间:2020-03-24 20:26

  浓缩胶和分离胶_生物学_自然科学_专业资料。浓缩胶和分离胶的 PH 值不同,前者主要表现为浓缩效用,后者表现为电荷效用和分子 筛效用。浓缩效应主要在浓缩胶中完成,浓缩胶的 pH6.8,在这个 pH 条件下,缓冲液中的 HCl 的 Cl 离子几乎

  浓缩胶和分离胶的 PH 值不同,前者主要表现为浓缩效用,后者表现为电荷效用和分子 筛效用。浓缩效应主要在浓缩胶中完成,浓缩胶的 pH6.8,在这个 pH 条件下,缓冲液中的 HCl 的 Cl 离子几乎全部解离,Gly 的等电点为 6.0,仅少数解离为负离子,在电场中移动速 度很慢。酸性蛋白质在此 pH 下解离为负离子,三类离子的迁移速率为 Cl一般蛋白质Gly, 电泳开始后,Cl 离子泳动快,在其后留下一个低离子浓度区。Gly 在电场中移动很慢,造成 移动离子的缺乏,于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区,在高压区内所有的负离 子都会加速移动,当移到 Cl 离子区域时,高电压消失,蛋白质的移动速度慢下来,当以上 稳定状态建立后,蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层,并按蛋白质所带 负电荷量的多少依次排列成带,浓缩样品,从浓缩胶进入分离胶后,胶的 pH 升高,Gly 的 离解度增大,泳动率上升,又因为它分子小,故超过所有的蛋白质分子,紧跟在 Cl 离子后, Cl 离子迁移后,低离子浓度不再存在,形成了恒定的电场强度,因此,蛋白质样品在分离 胶中的分离主要取决于它的电荷性质,分子大小和形状,分离胶的孔径有一定大小,对不同 相对质量的蛋白质来说,通过时收到的滞阻作用不同,即使静电荷相等的颗粒,也会由于这 种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开。 10%和 12%胶的差别: 根据你目的蛋白分子量而定,如果说是分子量较大的蛋白(60KD 以上),可以用 10%的 胶,分子量在 60~30KD 之间的可以用 12%的胶,低于 30KD 的我一般都是用 15%的胶 了。主要在于指示线刚好跑出胶底的时候,你的目的蛋白能够恰好处于胶的中间部分。 凝胶的浓度大小不同所对应的凝胶孔径大小也不同,浓度小的孔径大,浓度大的孔径 小,一般分离胶用 12%的,浓缩胶用 5%的,因为浓缩胶的目的就是将所有的蛋白浓缩在同 一起跑线上,然后一块进入分离胶分离。 据蛋白大小定。 Western Blot 转膜 在电流的作用下,使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上。 膜的选择:印迹中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 等。我们选用 PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附、物理强度,以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格:Immobilon-P(0.45um)和 Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa)。 A 半干法 即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间,通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流,起 到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上,所以其转移条件比较严酷,但是其转移时间 短,效率高。 1 实验条件的选择 电流 1mA-2mA/cm2,我们通常 100mA/膜,按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间 具体可以根据实际适当调整。 目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间 80---140 8% 1.5-2.0 25---80 10% 1.5 15—40 12% 0.75 20 15% 0.5 2 实验操作 (1)滤纸和膜的准备 (在电泳结束前 20 分钟应开始准备工作)。 A. 检查是否有足够的 transfer buffer,没有立即配制。 B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。 C. 将膜泡入甲醇中,约 1-2 分钟。再转入 transfer buffer 中。 D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入 transfer buffer 中。 PDVF 膜在进转移缓冲液时,要在甲醇里面泡多长时间? PVDF 是疏水性的,在转膜缓冲液里很难浸透,甲醇处理后使更容易浸润。 PVDF 的预处 理是用甲醇浸泡活化,浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合。 一般 5-20 分钟都有人在用。可在取胶的同时泡,估计前后 5 分钟左右。效果还不错。以前 有站友发贴,说处理时间没多大关系,关键看膜的质量.确实是这样的。只要让膜完全浸 透应该就没问题了。 Hybond 的 PVDF 说明书这样的写的:“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是,188金宝搏,至少 10 秒钟,多泡下也没关系的,事实上,泡 10 秒的做过, 10 分钟的也做过,都没有问题的。 (2)转移 A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。 B. 将膜铺在靠膜滤纸上,注意和滤纸间不要有气泡,再倒一些 transfer buffer 到膜上,保 持膜的湿润。 C. 将胶剥出,去掉 stack gel,小心的移到膜上。 D. 剪去膜的左上角,在膜上用铅笔标记出胶的位置。 E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些 transfer buffer,再铺两张靠胶滤纸。 F. 装好电转移仪,根据需要选定所需的电流和时间。 G. 转移过程中要随时观察电压的变化,如有异常应及时调整。 3 注意事项及常遇到的问题: 1)滤纸、胶、膜之间的大小,一般是滤纸=膜=胶。 2)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路。 3)因为膜的疏水性,膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中,膜也必须随时 保持湿润(干膜法除外)。 4)滤纸可以重复利用,上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质,所以上下滤纸 一定不能弄混,在不能分辨的情况下,可以将靠胶滤纸换新的。 5)转移时间一般为 1.5 小时,( 1mA-2mA/cm2,10% gel),可根据分子量大小调整转移时 间和电流大小。 1)在叠膜、胶、纸三明治时候,操作于盛有转膜 Buffer 的大平皿中进行,叠好后,再将三者 平行转移至转膜装置,切勿再移动,因为在 buffer 中操作,已经完全排除了气泡存在的可 能,无需再赶气泡 2)关于转膜时间:半干转的线min 即可 B 湿法 我们基本上不用此方法,这里暂不做介绍。 C 转移后效果的鉴定 1.染胶 用考马斯亮兰染色经 destain 脱色后,看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。 2.染膜 有两类染液选择,可逆的和不可逆的。可逆的有 ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS 等,这类染料染色后,色素可以被洗掉,膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料, 如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B 等,染色后膜就不能用于进一步的分析。